Очевидно, я не знаю лучшего пути, но вы можете использовать прямой путь.
new_lines = ['one \n', 'two \n']
with open('test.txt', 'r+') as f:
pos, text = 0, ''
while True:
# save last line value and cursor position
prev_pos, pos = pos, f.tell()
prev_text, text = text, f.readline()
if text == '':
break
f.seek(prev_pos, 0) # replace cursor to the last line
for line in new_lines: # write new lines
f.write(line)
f.write(prev_text) # write old last line