Просто вычтите все кадры данных, затем переназначьте нужные значения столбцу длины волны.
result = df_tot - df_nap
result['Wavelength'] = df_tot['Wavelength']
Например,
import numpy as np
import pandas as pd
df_tot = pd.DataFrame(np.random.randint(10, size=(3,4)), columns=list('ABCD'))
df_nap = pd.DataFrame(np.random.randint(10, size=(3,4)), columns=list('ABCD'))
# df_tot['A'] = df_nap['A'] # using column A as the "Wavelength" column
result = df_tot - df_nap
result['A'] = df_tot['A']
В качестве альтернативы, или если столбец длины волны не был числовым, вы можете вычесть все, кроме длины волны, а затем переназначить этот столбец:
result = df_tot.drop('Wavelength', axis=1) - df_nap.drop('Wavelength', axis=1)
result['Wavelength'] = df_tot['Wavelength']