Чтобы получить альфа-слой изображения RGBA, все что вам нужно сделать:
red, green, blue, alpha = img.split()
или
alpha = img.split()[-1]
И есть способ установить альфа-слой:
img.putalpha(alpha)
Ключ прозрачности используется только для определения индекса прозрачности в режиме палитры (P). Если вы хотите охватить случай прозрачности режима палитры и охватить все случаи, вы можете сделать это
if img.mode in ('RGBA', 'LA') or (img.mode == 'P' and 'transparency' in img.info):
alpha = img.convert('RGBA').split()[-1]
Примечание: метод convert необходим, когда для image.mode задан LA, из-за ошибки в PIL.