Вы должны использовать полный путь вместо относительного пути. Например: на основе пути вашего Python файла:
dir_of_imgs = os.path.join(os.path.realpath(os.path.dirname(__file__)), "dir")
И используйте эту переменную для определения пути к изображению:
img_path = os.path.join(dir_of_imgs, "video-frame-%06d.png")
Это означает, что ваша команда должна быть похожа например:
subprocess.Popen(['ffmpeg -i {} -c:v libx264 -vf "fps=25,format=yuv420p" out.mp4'.format(img_path), shell=True])
ПРИМЕЧАНИЕ:
Конечно, возможно, ваши файлы изображений находятся в другой папке, но вы можете использовать путь к вашему файлу Python как ссылка (как я покажу выше).