Если вы хотите сослаться на изображение в папке Theme, тогда я предлагаю использовать SkinId. Внутри файла скина каждой папки тем вы можете определить что-то вроде этого
<asp:Image runat="server" SkinId="HomeImage" ImageUrl="Images/HomeImage.gif" />
Когда вы используете изображение в своем коде, вы делаете что-то вроде этого ...
<asp:Image runat="server" SkinId="HomeImage" />
В зависимости от темы, выбранной вашим приложением, оно выберет правильное изображение из правильной папки Theme.
MyWebSite
App_Themes
Theme1
Default.skin
Default.css
Images
HomeImage.gif
Theme2
Default.skin
Default.css
Images
HomeImage.gif
Вот хорошая статья , объясняющая, как использовать темы, скины и устанавливать тему несколькими различными способами.