Dim str As String = "Test" & vbCrLf
str = str.Substring(0, str.Length - vbCrLf.Length)
то же самое с Environment.NewLine вместо vbCrlf:
str = "Test" & Environment.NewLine
str = str.Substring(0, str.Length - Environment.NewLine.Length)
Кстати, разница в следующем: Environment.NewLine зависит от платформы (например, возвращает другую строку в другой ОС)
Ваш remove
-приход не работал, потому что вы не присвоили возвращаемое значение этой функции исходной строковой ссылке:
str = str.Remove(str.Length - Environment.NewLine.Length)
или если вы хотите заменить все новые строки:
str = str.Replace(Environment.NewLine, String.Empty)