Наиболее вероятный ответ, который я могу себе представить, не зная больше о вашей ситуации, заключается в том, что папка «папка» не существует. Это не имеет ничего общего с os.sep.
Попробуйте это:
import os, os.path
folder = 'folder'
os.makedirs(folder)
with open(os.path.join(folder, 'file1.txt'), 'w') as f:
f.write('now my folder and file both exist!')