Где находится виртуальный каталог и каковы разрешения NTFS для него?
Когда IIS установлен, разрешения для inetpub \ wwwroot устанавливаются так, чтобы разрешить IIS доступ к этому каталогу, и любые каталоги в нем наследуют разрешения. Я предполагаю, что ваш виртуальный каталог указывает за пределы обычных веб-каталогов, и, следовательно, разрешения NTFS для каталога и файлов в нем исключают IIS.
Чтобы исправить это, откройте проводник и перейдите в каталог выше каталога, на который указывает ваш виртуальный каталог. Щелкните правой кнопкой мыши и просмотрите свойства, а затем выберите вкладку безопасности. Вам нужно будет отредактировать разрешения и, как минимум, предоставить права на содержимое папки IIS_IUSRS для чтения / чтения и выполнения / списка. Если ваш пул приложений запущен от имени другого пользователя, вам также необходимо предоставить этой учетной записи правильные разрешения.