Это всего лишь предположение: убедитесь, что учетная запись пользователя, под которой работает IIS, имеет доступ к закрытому ключу, связанному с сертификатом.
Если вы используете оснастку «Сертификаты MMC», выберите сертификат и затем щелкните правой кнопкой мыши -> Все задачи -> Управление личными ключами, и оттуда, если вы не видите учетную запись пользователя IIS в списке, вы можете добавить нажмите там кнопку «Добавить», а затем в появившемся диалоговом окне, если, например, вы запустили IIS в качестве сетевой службы, введите «сетевая служба» (с пробелом) и нажмите «Проверить имена», а затем, вернувшись к управлению личными ключами, вы можете установить безопасный доступ.
Я считаю, что вам нужно только разрешить доступ на чтение, чтобы использовать закрытый ключ для соединения TLS.
Вы можете установить доступ к закрытому ключу, независимо от того, установлен ли он на локальном компьютере или у текущего пользователя, но IIS не будет иметь доступа к вашему текущему пользователю, если он не будет работать как ваша учетная запись.
Кроме того, если это клиентский сертификат с закрытым ключом, он почти наверняка должен находиться в личном хранилище, а не в доверенных корневых центрах сертификации. Попробуйте локальный компьютер, персональный компьютер и предоставьте доступ к закрытому ключу учетной записи, под которой работает IIS (или приложение).