Возможно, это событие запускается, как и ожидалось, но, поскольку вы выполняете предварительно скомпилированный веб и в режиме выпуска, нет никаких символов отладки - в случае попытки удаленной отладки вашего приложения -.
Другая возможная причина - это срабатывание, но в обработчике Application_Start выдается некое исключение, и, поскольку он вызывается один раз в течение жизненного цикла приложения, вам потребуется перезапустить пул приложения или перезапустить весь IIS.