Вы можете просто сделать следующее:
<asp:ImageButton ID="ImageButton2" runat="server" Width="100px" Height="100px"
AlternateText='<%# this.ResolveUrl("~/images/" + Eval("Img_Id")) %>'/>
Вот ссылка на некоторую информацию, которая объяснит разрешение URL и путей.
РЕДАКТИРОВАТЬ: согласно моему комментарию, я думаю, что вы не используете правильное свойство, установите следующее свойство для отображения изображения.Ваш оригинальный вопрос выглядел так, как будто вы пытались установить свойство AlternateText
, которое не будет ничего делать для изображения:
ImageUrl='<%# this.ResolveUrl("~/images/" + Eval("Img_Id")) %>'