Согласно обзору жизненного цикла приложений ASP.NET
Application_Start: вызывается при запросе первого ресурса (например, страницы) в приложении ASP.NET. Метод Application_Start вызывается только один раз в течение жизненного цикла приложения. Этот метод можно использовать для выполнения задач запуска, таких как загрузка данных в кэш и инициализация статических значений.
В соответствии с вышесказанным, запуск или перезапуск пула приложений вызовет метод Application_Start.
Поэтому, когда вы запускаете, перезапускаете приложение, обновляете некоторые файлы в папке bin или обновляете web.config, Application_Start будет запущен в следующий раз, когда поступит запрос.