Используйте rsplit
по последнему разделителю и выберите последнее значение по позиции:
L = ['00:00:00:00:00:02', '00:00:00:00:00:01', '00:00:00:00:00:03',
'00:00:00:00:00:01', '00:00:00:00:00:04', '00:00:00:00:00:01']
out = [x.rsplit(':', 1)[-1] for x in L]
#alternative
#out = [x.split(':')[-1] for x in L]
Или получите последние 2 значения для каждого значения строки путем индексации:
out = [x[-2:] for x in L]
print (out)
['02', '01', '03', '01', '04', '01']