Настройка pictureBox.BackColor = Color.Transparent;
определенно должна работать.
Также проверьте, если вы устанавливаете альфа-канал цвета при использовании Color.FromArgb(0, 0, 0, 0)
; (это первый параметр, ноль означает прозрачный цвет)
И, конечно же, убедитесь, что ваши иконки имеют прозрачный фон.